Q1：为什么LncRNA测序通常采用“链特异性建库（Stranded Library）”？
LncRNA经常与其邻近或重叠的蛋白编码基因存在反义（Antisense）关系。普通建库在合成双链cDNA时会丢失方向信息，无法区分转录本究竟来自DNA的正链还是负链。链特异性建库能精确定位转录本的真实来源，准确鉴定反义LncRNA，并显著提高基因定量和转录本组装的准确性。
Q2：一次LncRNA测序数据，可以同时用来分析mRNA吗？
可以。 去rRNA的链特异性测序同时保留了LncRNA和mRNA。因此，一份测序数据可以同时获得LncRNA和mRNA的表达谱，这不仅节约了成本，还能消除批次效应，为后续构建“LncRNA-mRNA共表达网络”提供良好的数据基础。
Q3：LncRNA本身不翻译蛋白，如何预测它的生物学功能？
LncRNA主要通过调控靶基因来发挥功能，分析主要从两个维度进行预测：
顺式调控 (Cis-regulation)： 认为LncRNA调控其物理位置上相邻的基因。通常寻找LncRNA上下游 10kb 或 100kb 范围内的蛋白编码基因作为靶基因。
反式调控 (Trans-regulation)： 基于表达量的相关性。通过计算多样本中LncRNA与所有mRNA表达量的相关系数（如Pearson相关系数 > 0.9），寻找跨染色体或远距离共表达的靶基因。随后，将这些预测到的靶基因进行GO和KEGG富集分析，从而推断LncRNA的功能。
Q4：拿到差异表达的LncRNA列表后，如何挑选候选分子进行后续实验？
建议遵循以下优先级：
表达丰度： 优先挑选丰度较高的，太低的很难通过qPCR验证。
差异倍数与显著性： 挑选 Fold Change 大且 P-value/FDR 更小的分子。
结构可信度： 优先选择外显子数量 ≥ 2的LncRNA，单外显子LncRNA有时是基因组DNA残留或测序背景噪声。
已知功能关联： 优先选择其预测的靶基因恰好是研究通路中的关键基因。
Q5：为什么测序结果中显著差异的LncRNA，做RT-qPCR验证时却扩增不出来？
这是LncRNA研究中的常见问题，主要原因有：
反转录引物选择错误： 许多LncRNA没有Poly(A)尾。如果反转录时只用了Oligo(dT)引物，会导致无尾LncRNA无法逆转录为cDNA。须使用随机引物或总RNA反转录试剂盒。
本身丰度过低： LncRNA的组织特异性强且整体丰度低，超出了qPCR仪的稳定检测下限（Ct值 > 32）。
qPCR引物设计不佳： LncRNA序列常常含有较多重复元件，或者GC含量异常，导致引物特异性差或扩增效率低。
