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Q1: 寄生真菌或共生真菌(如菌根真菌、内生真菌)无法纯培养,可以直接测序吗?

可以,但这属于宏基因组的范畴。如果直接对混合样品测序,下机数据会包含宿主(植物/动物)和真菌的数据。

应对策略: 在分析时,需要通过生物信息学手段(如根据 GC 含量、覆盖度 Binning,或比对到已知的宿主基因组),挑出真菌的序列进行单独组装。但这非常依赖真菌与宿主的比例,若真菌生物量太低,测序成本会大幅增加。


Q2: 为什么真菌基因组测序普遍推荐“三代长读长 + 二代短读长”的联合策略?

真菌基因组中普遍存在大量的重复序列、转座子以及高度重复的次级代谢产物基因簇(BGCs)二代测序读长短(150 bp),遇到这些重复区域就如同拼图时遇到大片纯色区域,极易拼错或断开,导致基因组非常碎片化(Scaffold 数量多)。三代测序(PacBio HiFi Nanopore)读长长,可以直接跨越这些复杂重复区域,实现染色体级别的组装(甚至 T2T 完美基因组)。

注: 如果使用 PacBio HiFi 测序,由于其本身准确率极高,甚至可以不需要二代数据进行矫正;若使用普通 Nanopore 测序,则通常需要二代数据来纠正单碱基的 Insertion/Deletion错误。


Q3: 什么是双核真菌?它对组装有什么影响?

许多大型真菌(如香菇、平菇、木耳等担子菌)在生活史的大部分时期是双核体(),即一个细胞内含有两个独立的、遗传物质不同的细胞核。这导致测序时面对的是两套高度杂合的基因组。

影响: 传统的单倍体组装软件会把等位基因区域误认为是不同的基因,导致组装出来的基因组偏大、碎片化。

解决方案: 现在通常使用专门的单倍型分型组装软件(如 Hifiasm),可以直接将两套基因组(A 单倍型和 B 单倍型)分别完整地组装出来(Haplotype-resolved assembly)。


Q4: 线粒体基因组会自动包含在全基因组测序结果中吗?

会。 在全基因组总 DNA 中,线粒体 DNA的拷贝数通常远高于核 DNA。因此,下机数据中会包含大量的线粒体 Reads。

在组装核基因组时,线粒体序列通常会拼成一根或几根覆盖度极高(通常是核基因组的数倍到数十倍)的 Contig。

建议在后续分析中,将线粒体 Contig 单独提取出来,使用专门的线粒体组装和注释软件(如 GetOrganelle、Mitofy)进行单独分析。


Q5: 为什么真菌基因组注释通常强烈建议配合转录组(RNA-seq)数据?

真菌作为真核生物,其基因含有内含子(Intron)和外显子(Exon)

纯粹依靠软件进行从头预测或同源预测,在识别内含子边界(剪切位点)时经常不够准确,容易导致基因预测断裂或融合。

RNA-seq 数据提供了该真菌在实际表达时的真实转录本证据。将 RNA-seq 数据回比到基因组上,能够精准定位外显子边界,极大地提高基因结构注释的准确性。


Q6: 真菌基因组功能注释中会用到哪些特色数据库?

除了常规的 NR、Swiss-Prot、COG/KOG、GO KEGG 之外,真菌项目通常包含以下特色数据库:

CAZy(碳水化合物活性酶数据库): 真菌(特别是植物病原菌和腐生菌)含有大量的木质纤维素降解酶,CAZy 注释对研究其降解底物能力至关重要。

antiSMASH(次级代谢产物基因簇预测): 真菌是抗生素、毒素和各种生物活性物质的重要来源,该工具可以预测非核糖体肽合成酶(NRPS)、聚酮合酶(PKS)等基因簇。

PHI-base(病原生物与宿主互作数据库): 如果研究的是植物或动物病原真菌,该数据库可以鉴定出与致病力(Virulence)、效应子(Effector)相关的基因。

DFVF(真菌毒力因子数据库)或 Secretome预测(分泌蛋白): 用于筛选真菌向细胞外分泌的武器(如效应蛋白、水解酶)。

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