Q1：Small RNA建库的流程与普通转录组有什么本质区别？
Small RNA建库不需要打断。由于目标分子本身很短（如miRNA通常只有18-24 nt），建库时会利用RNA连接酶直接在RNA分子的3'端和5'端连接特异性接头，然后进行反转录和PCR扩增。最后，必须经过严格的切胶回收或磁珠分选，精准提取目标长度的片段。
Q2：数据分析中，如何区分reads是miRNA还是降解的垃圾RNA？
生信分析会进行严格的序列比对和注释分类。首先会去除带接头的、低质量的、过短（<18nt）的reads。然后将Clean reads比对到多种数据库（如Rfam），优先把 rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 等其他类型的RNA过滤掉，剩下的序列再比对到 miRBase 数据库鉴定已知miRNA，或通过 miRDeep2 等软件基于前体发夹结构预测Novel miRNA。
Q3：如何预测发现的差异miRNA的功能？
miRNA通过与靶基因结合（通常是mRNA的3'UTR区）导致靶基因降解或翻译抑制来发挥功能。分析时通常使用 TargetScan、miRanda、RNAhybrid 等多款主流软件预测靶基因，并取交集以降低假阳性。
